[МУЗЫКА] [МУЗЫКА]
Мы уже много раз говорили о том, как удобно с
помощью метода пронуклеарной микроинъекции получать трансгенных животных.
В этой лекции я предлагаю обсудить недостатки этого метода.
Как, я думаю, понятно, идеальных методов нет, и даже у такого
замечательного метода, как пронуклеарная микроинъекция, есть свои недостатки.
И для начала давайте посмотрим ещё раз,
как происходит процедура пронуклеарной микроинъекции.
На этом видео очень хорошо видно,
что это достаточно травматичная процедура для самого эмбриона.
И видно, что при инъекции вводится достаточно большое количество,
достаточно большой объём раствора ДНК.
Настолько большой, что видно очень хорошо, как пронуклеус увеличивается в размерах.
И это имеет свои последствия, такое увеличение.
Поскольку при проколе пронуклеуса и при его увеличении в объёме
происходят различные разрывы ДНК.
С одной стороны, это, конечно, плюс, поскольку, как мы уже знаем,
именно по разрывам в ДНК, в геномной ДНК, происходит интеграция трансгена.
Но с другой стороны, это и минус, поскольку мы заранее никак не можем
предсказать, в каком месте генома произойдёт разрыв.
А это значит, что мы заранее не можем предсказать,
в какое место генома встроится трансгенная конструкция.
Итак, первый недостаток метода — это непредсказуемое место интеграции.
Почему это плохо?
Дело в том, что, как, наверно, в каждом городе,
есть хорошие район, есть плохие районы, и все хотят жить в хороших районах,
никто не хочет оказаться ночью в плохом районе,
так же и в геноме отдельные его регионы имеют разные свойства.
Есть районы активного хроматина, так называемого открытого хроматина,
в котором экспрессируются различные гены,
и процесс этот, транскрипции, происходит очень активно.
С другой стороны, есть гетерохроматин, так называемый закрытый хроматин,
в котором ДНК очень плотно упакована,
и там не происходит процессов активной транскрипции.
Это означает, что если попасть в район открытого хроматина, то,
скорее всего, ваш трансген будет активно экспрессироваться.
А если он попадёт в район закрытого хроматина, есть шанс, что трансген,
даже несмотря на то, что он будет собран правильно, он не будет работать.
И это действительно плохо, поскольку вынуждает исследователей и людей,
занимающихся получением трансгенных животных,
получать сразу несколько линий трансгенных животных, для того чтобы иметь возможность
отобрать те линии, в которых произошла интеграция в такое место генома,
который не мешает нормальной работе трансгенной конструкции.
Ещё один недостаток — это возможность так называемого инсерционного мутагенеза.
Дело в том, что, по некоторым оценкам,
интеграция трансгенной конструкции в геноме происходит очень часто в гены.
В принципе, гены занимают не такое большое,
не такое большое место в геноме, я уже говорил об этом.
Но оказывается, что от 5 % до 20 % всех трансгенных животных имеют
нарушения в месте интеграции, нарушения работы генов в месте интеграции трансгена.
И бывает даже так,
что интеграция трансгена приводит к полному «замолканию» одного из генов.
И это действительно плохо, поскольку, во‐первых,
такой ген может оказаться очень важным для выживания животного, и, таким образом,
трансгенный эмбрион просто погибнет.
Во‐вторых, выключение одного из генов может просто сказаться на свойствах
трансгенного животного.
Это очень важно, если вы, скажем,
с помощью трансгенного животного пытаетесь промоделировать какое‐нибудь заболевание.
Может оказаться так, что тот фенотип, который вы наблюдаете, вызван совсем не
экспрессией, не работой трансгена, а нокаутом в месте интеграции трансгена.
И это второй минус пронуклеарной микроинъекции.
Третий минус, о котором мы, в принципе, уже упоминали,
когда разбирали механизмы интеграции трансгенной конструкции, — это то,
что зачастую при пронуклеарной микроинъекции встраивается не одна копия,
я сразу несколько, причём непредсказуемое количество копий трансгенной конструкции.
И это тоже бывает плохо, поскольку зачастую повторённые элементы в геноме,
они могут подвергаться так называемому сайленсингу, то есть «выключению»,
они работают не так, множество копий трансгена работает не так же,
как единственная копия.
И это тоже плохо.
И в заключение этого раздела я хотел бы привести один пример из нашей лаборатории,
в которой мы получаем трансгенных животных, трансгенных мышей, который очень
хорошо иллюстрирует все вот эти недостатки метода пронуклеарной инъекции.
Дело в том, что мы создавали трансгенных животных,
которые бы могли продуцировать в молоко белки человека.
И для реализации этого проекта мы тестировали различные
конструкции на то, насколько они хорошо работают.
А для этого нам нужно было получить трансгенных мышек,
которые бы в молоко продуцировали белок человека.
В один из случаев, в один из разов мы получили трансгенную мышку,
у которой произошла интеграция трансгенной конструкции сразу в тысячи копий
трансгенных конструкций, то есть это совершенно огромный кластер вот
этих копий трансгена, причём интеграция произошла в Y‐хромосому.
Давайте разберёмся, какие последствия имела такая интеграция.
Ну, во‐первых, вот эта тысяча копий, она, возможно, не работала.
Я говорю — возможно, потому что мы так и не смогли её проверить,
поскольку Y‐хромосома имеет свою особенность при наследовании: она всегда
наследуется от отца к сыну, от отца к сыну, и так в череде поколений.
Как вы понимаете, ни отцы, ни сыновья не дают молока.
Это означает, что просто нет возможности на такой трансгенной мышке проверить,
работает ли трансгенная конструкция,
которая должна активироваться только в момент лактации и только у самок.
В принципе, можно ждать хоть до скончания времён, но не дождаться возможности
проверить, правильно ли собрана такая трансгенная конструкция.
И в заключение этой лекции ещё один
недостаток метода пронуклеарной микроинъекции.
Дело в том, что интеграция трансгенной конструкции необязательно происходит на
стадии одной клетки, на стадии, когда эмбрион представлен всего одной клеткой.
В принципе, было бы здорово, если бы это было так, поскольку при такой интеграции
весь родившийся организм трансгенный состоял бы из трансгенных клеток.
Однако на практике оказывается так, что зачастую интеграция происходит позже
одноклеточной стадии, например, на стадии двух клеток.
И интеграция происходит, например, только в одной из двух клеток.
Это приводит к тому, что родившиеся трансгенные животные лишь
наполовину состоят из трансгенных клеток.
Чем это плохо?
Тем, что смесь трансгенных и нетрансгенных клеток,
она каждый раз возникает уникальная.
И это означает, что свойства такого вот животного,
которое является такой своеобразной смесью из трансгенных и нетрансгенных клеток,
они каждый раз тоже будут разные.
Значит, что такое животное сразу нельзя использовать, например, в каких‐то
экспериментах, поскольку он будет мало воспроизводим.
И второй недостаток — такое животное будет иметь в два раза меньше трансгенных
потомков, чем животное, у которого интеграция произошла на стадии одной
клетки, поскольку есть вероятность, что половина клеток,
из которых разовьются гаметы, будут нетрансгенные.
В принципе, случается так, что интеграция происходит и позже,
чем на стадии двух клеток.
Например, если произойдёт интеграция на стадии четырёх клеток только в одной из
клеток, то всего четверть организма трансгенного будет состоять из трансгенных
клеток Но в принципе, бывает и гораздо на более поздних стадиях.
Тогда вероятность передачи трансгена, скажем,
в следующее поколение и получения трансгенной линии животных резко падает.
Давайте сделаем вывод из этой лекции.
Какие же всё‐таки недостатки имеет метод пронуклеарной микроинъекции?
Первый, самый большой недостаток — это то,
что интеграция трансгенной конструкции происходит в непредсказуемое место генома.
Это значит,
что свойства трансгенного организма могут зависеть от места интеграции.
Во‐вторых, интеграция трансгенной
конструкции может привести к выключению генов в районе интеграции, это тоже плохо.
Это будет называться инсерционным мутагенезом.
Третий недостаток — то, что зачастую трансгенные конструкции
встраиваются в виде тандема и сразу нескольких копий, что тоже мало
предсказуемое оказывает влияние на итоговые свойства трансгенного животного.
И заключительный недостаток — то, что интеграция может происходить позже, чем
на стадии одной клетки, и это приводит к тому, что трансгенное животное, родившееся
в первом поколении, будет иметь небольшую долю трансгенных клеток в своём организме.
Алексей Мензоровкандидат биологических наук, старший преподаватель
Нариман Баттулинкандидат биологических наук, старший преподаватель
Вениамин Фишманкандидат биологических наук, преподаватель
